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ELISA實(shí)驗(yàn)中的洗板步驟關(guān)鍵環(huán)節(jié)
點(diǎn)擊次數(shù):64 更新時(shí)間:2025-06-17

ELISA實(shí)驗(yàn)是一種利用特定抗體與抗原或半抗原發(fā)生的高選擇性高特異性識(shí)別和結(jié)合原理,對(duì)待測(cè)抗體或者抗原進(jìn)行分析測(cè)定的方法,酶聯(lián)免疫吸附分析(下稱ELISA)是免疫分析的一種,分三個(gè)部分組成:免疫識(shí)別,信號(hào)輸出和數(shù)據(jù)處理。

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ELISA實(shí)驗(yàn)中的洗板步驟是確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵環(huán)節(jié),涉及多個(gè)關(guān)鍵點(diǎn):

1. 洗滌參數(shù):

   - 洗滌量:自動(dòng)洗板機(jī)通常建議使用350µl的洗滌液來確保清洗整個(gè)反應(yīng)孔的壁。洗滌量應(yīng)比包被體積稍高,以減少未結(jié)合抗體的背景信號(hào)。

   - 均勻性:所有反應(yīng)孔的洗滌量必須一致,確保每次洗滌都達(dá)到相同的效果。

2. 洗滌次數(shù):

   - 一般建議:在每次抗體或抗原孵育后重復(fù)洗滌3次。對(duì)于用戶包被的ELISA板,可能需要優(yōu)化洗滌次數(shù),因?yàn)榘黄桨逋ǔP枰南礈齑螖?shù)較少。

   - 平衡背景與信號(hào):過多的洗滌會(huì)降低信號(hào)強(qiáng)度,而過少則會(huì)導(dǎo)致背景值升高。因此,需要找到一個(gè)平衡點(diǎn)。

3. 洗板方法:

   - 自動(dòng)洗板機(jī):使用洗板機(jī)可以減少人為因素,提高速度和一致性,但需確保洗板機(jī)設(shè)置正確,包括洗滌量和次數(shù)。

   - 手工洗板:手工洗板時(shí),要注意洗液不要溢出孔外,加洗液后靜置1分鐘,然后大力拍干,確??變?nèi)無殘留液。

4. 洗液:

   - 配置:使用新鮮的、高質(zhì)量的超純水或雙蒸水配制洗液,避免使用受污染的水。

   - 稀釋倍數(shù):按照試劑盒說明書稀釋,過高或過低的稀釋倍數(shù)都可能影響洗滌效果。

5. 注意事項(xiàng):

   - 避免污染:每次加樣和洗滌后,應(yīng)更換封板膜,防止交叉污染。

   - 拍板技巧:手工洗板時(shí),拍板要用力但避免過度,以確保孔內(nèi)無殘留液,同時(shí)防止樣本干涸。

   - 重復(fù)性:確保每次操作的加樣量、時(shí)間和條件一致,以提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。

6. 溫度控制:

   - 溫育:溫育溫度通常為37℃,應(yīng)嚴(yán)格控制,避免溫度波動(dòng)影響反應(yīng)。

   - 避免邊緣效應(yīng):使用水浴或加熱板使整個(gè)板達(dá)到均勻溫度,減少邊緣孔與中心孔的溫差。

7. 顯色與終止:

   - 顯色時(shí)間:根據(jù)試劑盒說明控制顯色時(shí)間,避免過長(zhǎng)導(dǎo)致背景增高或過短導(dǎo)致結(jié)果偏低。

   - 終止液:加入終止液時(shí)要確保無氣泡,終止反應(yīng)后立即讀數(shù)。

8. 問題排查:

   - 背景高:可能是洗滌不徹di或洗滌次數(shù)不足。

   - 白板:可能是忘記加酶或顯色液,或試劑污染。

   - 重復(fù)性差:檢查加樣量、操作時(shí)間和條件是否一致,以及樣本和試劑的穩(wěn)定性。

遵循這些關(guān)鍵點(diǎn)和注意事項(xiàng),可以有效提高ELISA實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性,確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。


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